LABIOFAM: analisi della sostanza

Materiali e Metodi :
Scorpioni : Gli scorpioni della specie di  Rhopalurus junceus utilizzata negli esperimenti sono nel escorpionario che appartiene ai laboratori Biologico-Farmaceutici (LABIOFAM). Gli scorpioni adulti che sono stati usati sono stati mantenuti alla temperatura ambiente e sono stati alimentati con gli insetti, pricipalmente i grilli Periplaneta (blatta) fornito una volta alla settimana.

 

 

Il veleno è stato ottenuto tramite  stimolo elettrico dalle punture degli scorpioni’, con pause almeno di 21 giorno senza estrarre il veleno. Il veleno ottenuto è stato diluito  in acqua distillata, centrifugata a 15 000 giri/min. per 20 minuti per la rimozione dei costituenti quali muco e residui cellulari. Per concludere, immagazzinati in fiale da 1.5 ml ed immagazzinati -20 a ° C fino ad uso. Gli studi precedenti hanno indicato che l’immagazzinaggio a questa temperatura non interessa significativamente le caratteristiche dell’estratto. La concentrazione nella proteina è stata calcolata in tutti i casi con il metodo modificato di Lowry.

 

 

Cromatografia a fase mobile liquida a bassa pressione (CLBP): Il veleno è stato dissolto in acetato di ammonio da 0.1 m. (NH4Ac) da vortice ed è stato centrifugato a 15 000 giri/min. per 20 minuti. Il galleggiante è stato iniettato su un Superdex colonna di cromatografia d’esclusione da 75 HR 10/30, con le dimensioni di 10 x 300 millimetri d’applicazione su un sistema di AKTA FPLC (Amersham Pharmacia Biotech). La colonna è stata equilibrata con 0.1 m. di NH4Ac ed il materiale eluito nello stesso solvente ad una portata di 0.5 ml/minuto. L’eluizione del materiale è stata controllata ad una lunghezza d’onda di 280 nanometri per 72 min. Parecchie frazioni cromatografiche del runsand sono state effettuate con i simili tempi di ritegno, raccolto, fuso, dializzati e la concentrazione è stata calcolata come descritto precedentemente. La separazione e l’accumulazione di frazioni del veleno sono state effettuate alla temperatura ambiente. Determinazione delle masse molecolari relative:  per determinare la massa molecolare relativa è stato usato un kit commerciale della  (Amersham Pharmacia Biotech): la ribonucleasi A (kDa 13.7), il chymotrypsinogen (kDa 25), l’ovalbumina (kDa 43), l’albumina (kDa 67) ed il dextrano blu 2000 e sono stati fatti centrifugare nelle stesse condizioni del veleno. A partire dai tempi di ritegno e dalle masse molecolari conosciute una curva di calibratura è stata costruita per determinare le masse molecolari relative delle frazioni differenti della proteina ottenute durante la cromatografia.
Elettroforesi del gel di poliacrilammide: I campioni e le frazioni del veleno sono stati analizzati nell’elettroforesi della proteina in nessun termini riducentesi, in gel di separazione 16% e gel d’impilamento di 4% e sono stati fatti funzionare in un alloggiamento di elettroforesi (Biorad, ll Mini-) di PROTEANR. In ciascuno si è aggiunto bene un importo equivalente ad un veleno dei 50 μgof e ad un μgof 10 ogni frazione. Il peso molecolare è stato valutato dagli indicatori intermedi del peso molecolare, paralelamente funzionamento con i campioni. Il funzionamento è stato effettuato a 120 V, 400 mA per 2 ore. Il gel è stato colorato con Coomassie G-250 blu (sigma) e una soluzione distintiva è stata usata per visualizzare le fasce della proteina.
Tipi di cellule: Nello studio sono stati utilizzati tre varietà di cellule tumorali: Hela (atcc CCL-2, carcinoma cervicale umano), Hep-2 (atcc CCL-23; carcinoma umano della laringe), NCI-H292 (atcc CRL-1848; carcinoma del polmone) e linea diploide MRC-5 (atcc CCL-171, fibroblasti umani del polmone).Le varietà di cellula Hela, Hep-2 e MRC-5 si sono sviluppati in matrici di cultura nel mezzo essenziale minimo (MEM, sigma), completato con 2 millimetri di glutammina e di amminoacidi non indispensabili e 10% del siero di bue fetale (SFB). La linea NCI-H292 si è sviluppata in RPMI-1640 (sigma) completata con 2 millimetri di glutammina e 10% di SFB. Ogni linea è stata incubata in un’atmosfera umida 37 a ° C al CO2 di 5% fino a formazione dello strato monomolecolare. Ogni varietà di cellula era distaccata dal trattamento con 0.25% di una soluzione della tripsina e pronto ad una concentrazione di 2 x 105 cellule/ml.
Analisi di citotossicità: L’effetto del veleno è stato rilevato con il metodo di Mosmann. La prova è stata effettuata sulle piastrine del polistirolo della parte inferiore piana e di 96 pozzi per la coltura delle cellule (costar di Corning Inc. R). In ciascuno si è aggiunto bene 50 ml di ogni varietà di cellula ed è stato incubato in un’atmosfera del CO2 di 5% 37 a ° C per 24 ore. Dopo questo tempo, 50 ml di terreno di coltura si sono aggiunti per ogni varietà di cellula, precedentemente dissolto con veleno per ottenere bene una concentrazione finale di 0.25, 0.5, 0.75 e 1 mg/ml in ciascuno. L’effetto delle frazioni è stato valutato in Hela, cellule NCI-H292 e MRC-5. La concentrazione finale delle frazioni era risoluta dalle percentuali che ciascuna rappresenta nel veleno. Tutti i varietà di cellula hanno avuti una concentrazione finale di 104 cellule/buono e lo SFB è stato utilizzato nel mezzo ad un 10%.
L’atmosfera dove è stata versata la sostanza  è stata del 5% dei piatti 37 a ° C per i tre giorni. Dopo che questo  si è aggiunto 10 ml di soluzione sterile di tetrazolium 25difenil (MTT) (sigma) del metile 3 – (4,5-dimethylthiazol-2-yl) – a 5 mg/ml in un buffersolution sterile del fosfato in ciascuno pozzo ed è stato incubato nelle stesse circostanze per 3 ore. Per concludere, 100 L/buoni si è aggiunto di solfossido dimetilico (DMSO, sigma) ed è stato incubato per 10 minuti. La capacità di assorbimento è stata determinata in una rivelazione di tecnologie MRX di Dynex del lettore del microplate di ELISA ad una lunghezza d’onda di 560 nanometro con riferimento di 630 nanometro. Ogni concentrazione è stata effettuata in triplice copia e la prova è stata ripetuta tre volte.

Le curve di concentrazione-risposta sono state ottenute descrivendo la capacità di assorbimento contro le concentrazioni differenti di veleno. La citotossicità è stata espressa come CC50, la concentrazione del veleno che causa una diminuzione di 50% nel numero delle cellule possibili (capacità di assorbimento di MTT) rispetto ai comandi non trattati. I valori CC50 di veleno e le frazioni erano risoluti dalle curve di concentrazione-effetto (% di proliferazione delle cellule) con l’analisi lineare, using la versione statistica del prisma 4.03 di GraphPad del pacchetto (GraphPad Software, Inc.).

 

Apoptosi:  Per l’analisi di frammentazione del DNA, Hela, delle varietà di cellula Hep-2 e NCI-H292, sono stati coltivati in 12 piatti dei pozzi e sono stati incubati 37 a ° la C, CO2 di 5% per 24 ore in un’atmosfera umida. Dopo questo tempo, 0.5 mg/ml si sono applicati in ogni varietà di cellula e sono stati incubati negli stessi termini per 48 ore e sono stati usati come comandi, varietà di cellula del culturedwith dei pozzi senza veleno. Il DNA è stato estratto a 24 e 48 ore, using il sistema 11purification del corredo di purificazione del DNA di WisardR Genomic (Promega). Il DNA estratto è stato fatto funzionare in un’elettroforesi sottomarina a 70 V, 30 mA per 1-2 ore using un’agarosi 1.2%.

 

Analisi statistica: Tutti i dati sono stati analizzati per di distribuzione normale. L’analisi della varianza (ANOVA) è stata effettuata ha seguito da una prova multipla della gamma di Duncan che usando la versione statistica del prisma 4.03 di GraphPad del pacchetto (GraphPad Software, Inc.). In tutti i casi la differenza è stata considerata significativa per la p <0.05.

 

Risultati
Cromatografia molecolare di esclusione: Figura 1 mostra il cromatogramma del veleno e delle frazioni ottenuti. Il veleno è stato eluito per 72 minuti ad una portata costante di 0.5 ml/minuto controllato a 280 nanometro. Il profilo cromatografico ha mostrato ad una gamma di elutionfrom 19 minuti – 72 minuti. La frazione di FI rappresenta l’unione delle proteine dal kDa 14 al kDa 70. I profili cromatografici hanno avuti una media di otto picchi. Le frazioni di FII, di FIII e di FIV hanno mostrato le masse molecolari relative kDa 8 del kDa, 4 e kDa <3, rispettivamente.
Elettroforesi del gel di poliacrilammide: Figura 2 mostra il modello elettroforetico del veleno e delle frazioni ottenuti dalla cromatografia di cromatografia d’esclusione. L’elettroforesi ha mostrato la presenza di due fasce identificate kDa 45 al kDa, 66 kDa e 29. La fascia di maggioranza è stata situata inferiore al kDa 14, indicante che la maggior parte del soddisfare del veleno è fatto delle proteine molecolari del peso basso. La frazione di FI ha mostrato un modello elettroforetico simile al veleno pieno. Le frazioni F-II, F-III e F-IV hanno mostrato una singola fascia inferiore al kDa 14, che dimostra che corrisponde alle proteine molecolari del peso basso.
Citotossicità:  La valutazione dell’attività citotossica del veleno è stata fatta in tre varietà di cellula del tumore ed in una linea diploide del polmone umano.
I risultati hanno indicato che il veleno ha interessato significativamente (p <0.05) lo sviluppo delle cellule del tumore confrontate alle cellule normali (frazioni della Tabella 1).I risultati ottenuti sono stati raggruppati in 4 gruppi e sono stati valutati in Hela, nelle varietà di cellula NCI-H292 e MRC-5. Il FI è risultato essere più tossico a MRC-5 mentre F-II ha mostrato i simili livelli di sensibilità per le tre varietà di cellula. Il F-III ha mostrato un’inibizione significativa di sviluppo delle cellule del tumore (p <0.05) confrontato alle cellule normali, simili a quella osservata per il veleno pieno. La frazione di F-IV ha mostrato appena CC50 significativamente più basso (p <0.05) che le caselle normali per NCI-H292 le cellule (1). In tutti i casi (veleno, FIII, FIV) la varietà di cellula NCI-H292 era il più sensibile.

Valori CC50 della tabella 1. del veleno e delle frazioni per le varietà di cellula provate. La gamma dei tempi di ritegno, le proporzioni di ogni frazione nel veleno ed i pesi molecolari relativi sono presentati. TR: tempo di ritegno; Ap/a: zona dei picchi/dell’area totale; SIG.: le masse molecolari relative ottenute statisticamente da una curva di calibratura del TR contro la massa molecolare della proteina della massa molecolare conosciuta * significativo di differenza di p <0.05 confrontato alla varietà di cellula MRC-5.

Apoptosi: l’induzione del apoptosis, dovuto l’effetto del veleno, è stata osservata dal modello di frammentazione del DNA (figura 3).In tutte e tre le varietà di cellula è stata osservata l’evento del apoptosis come meccanismo di morte delle cellule, maggiorate mentre il tempo di incubazione con il veleno è aumentato. Ciò indica che più alto il tempo di incubazione è più cellule muoiono come conseguenza di questo evento. Il cambiamento morfologico si è presentato nella varietà di cellula Hela del tumore, dovuto la tossicità del veleno; ciò è indicata nella figura 4. La coltura ha formato uno strato monomolecolare omogeneo nel controllo senza veleno (figura 4A). L’applicazione di veleno alle concentrazioni basse ha provocato la perdita di morfologia tipica delle cellule e la rottura dello strato monomolecolare. L’aumento nelle concentrazioni di veleno ha causato i cambiamenti cellulari connessi con l’allungamento delle cellule e l’irregolarità dei bordi delle cellule (figura 4B). Le più alte concentrazioni hanno causato la distruzione totale della cellula dello strato monomolecolare, la fusione delle membrane delle cellule e la formazione di grandi vacuoli dal giunto del contenuto citoplasmico di varie cellule e la formazione di cincitios. Le cellule con l’aumento di volume inoltre sono state osservate così come le cellule necrotiche con il pyknosis e il residuesin cellulare il terreno di coltura (fig. 4C, 4D).
Discussione
Tramite questo documento è stato presentato la descrizione parziale del veleno cubano dello scorpione di junceus di Rhopalurus. I risultati dell’elettroforesi della proteina hanno mostrato che la presenza di fasce della proteina fra kDa 29 il kDa e 67 e di fascia inferiore al kDa 14 quale corrispondono ad altro lavora al veleno dello scorpione in cui la maggior parte del relativo soddisfare è delle proteine a basso peso molecolare [12.13]

Il veleno totale e le frazioni di F-IV e di F-III hanno mostrato una citotossicità significativa e differenziale alle cellule del tumore. La frazione di F-IV ha mostrato soltanto la tossicità significativa a NCI-H292. I principi attivi attuali nella frazione di F-III che causano la riduzione significativa di attuabilità delle cellule in Hela possono essere ad una concentrazione più bassa o non assente nella frazione di FIV. Da un lato, l’alta sensibilità della varietà di cellula NCI-H292 in tutti i casi (veleno, FIII, FIV) potrebbe essere dovuto più di una componente capace di comportarsi nel veleno di uno scorpione su queste cellule. Le frazioni di FIV e di FIII hanno mostrato il kDa relativo di 4 delle masse molecolari più basso. I veleni dello scorpione contengono le proteine con le masse molecolari inferiore al kDa 8 e sono considerati tossine [13]. L’azione fisiologica di queste tossine è impiegata pricipalmente sulle scanalature dello ione presenti nelle membrane delle cellule dei mammiferi e gli insetti ed alcuni sono specifici ad ogni specie [14.15]. Nel cancro, in alcuni tipi di tumori, la proliferazione, l’espansione e l’invasività sono associate con sovraespressione in scanalature dello ione della membrana delle cellule [16] e ricevitori delle cellule [17]. Il blocco dell’attività fisiologica di questi scanalature e ricevitori dello ione inibisce la proliferazione e l’espansione di queste cellule [18]. L’alta affinità del veleno di alcuni scorpioni attraverso queste scanalature dello ione e dell’aumento nella densità di queste scanalature nelle membrane delle cellule del tumore facilita una maggior selettività e quindi un aumento nella tossicità verso queste cellule [19]. Questa caratteristica potrebbe essere collegata con la tossicità differenziale del veleno e le frazioni di F-IV e di F-III sulle varietà di cellula hanno studiato.

L’evento del apoptosi è stato rilevato nelle varietà di cellula del tumore. L’avvenimento di degradazione del DNA, dopo 24 ore di incubazione, nelle varietà di cellula HeLa ha indicato che questo è più probabile sviluppare il apoptosis. Le più alte concentrazioni del veleno hanno causato un aumento nel volume delle cellule ed in alto pyknosis che possono indicare la presenza di necrosi. Questi risultati sono costanti con quelli ottenuti da Omran MAA [20] che using il veleno dello scorpione di quinquestriatus del L. sulle varietà di cellula eucariotiche 293T e C2C12 nelle concentrazioni differenti, osservato che soltanto in una sottopopolazione del numero totale delle cellule si è presentato l’evento del apoptosis mentre nella popolazione restante altri eventi hanno avvenuto compreso necrosi. Altri autori accosentono che ci è una doppia strada che quello conduce alla morte delle cellule. Un evento caratterizzato dal apoptosis e dall’altro da necrosi, che è mascherata normalmente dal primo [21.22].

Conclusioni

In questo lavoro il veleno dello scorpione di junceus di Rhopalurus ha mostrato una tossicità significativa sulle cellule del tumore dell’origine epiteliale. Ulteriormente, la relativa massa molecolare fractions più basso il kDa di 4, indicato la simile citotossicità su questo tipo delle cellule. Anche se questo lavoro non è stato diretto verso l’identificazione degli obiettivi cellulari, il fatto che ci è uno stretto rapporto fra le scanalature dello ione e proliferazione del tumore, metastasi, espansione ed invasività e che i peptidi presenti nel veleno dello scorpione si permettano di suggerire che i principi attivi dell’atto del veleno di Rhopalurusjunceus lo stesso senso. Ulteriori studi dovrebbero essere effettuati per l’identificazione dei principi attivi ed il relativo rapporto con le scanalature dello ione.

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