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– VELENO DELLO SCORPIONE RHOPALURUS JUNCEUS –

L’uso di prodotti di origine naturale nella medicina tradizionale ed alternativa é una pratica attualmente molto estesa nella maggioranza dei Paesi. Nel caso dei veleni dello scorpione, pochi anni fa iniziarono ad evidenziarsi le sue potenzialitá farmacologiche. A Cuba esistono 32 specie e sottospecie di scorpioni, 28 delle quali endemiche, essendo tra le piú comuni quella dello scorpione Rhopalurus junceus. Questa specie é stata impiegata nella medicina cubana tradizionale con l’applicazione nel basso ventre nel caso di ritenzione urinaria e nel miglioramento di alcune malattie. A Cuba i veleni dello scorpione sono stati scarsamente studiati, per queste ragioni l’obiettivo di questa ricerca é di realizzare la caratterizzazione del veleno dello scorpione cubano Rhopalurus junceuse la valutazione delle sue potenzialitá come agente antitumorale.

L’analisichimica ha rilevato la presenza di ammine, carboidrati e lipidi. Studi di spectrometria hanno identificato la presenza di basse quantitá di ioni di Na, K, Mg, Cu e Zn nell’estratto. L’elettroforesi in gel di poliacrilamideha mostrato un profilo di proteine tra i 90 kDa-14 kDa. Sotto i 14 kDa si é osservata una banda maggioritaria. La cromatografia liquida di filtraggio in gel ha confermato la presenza di un alto contenuto di proteine di basso peso molecolare. La valutazione dell’attivitá proteolitica impiegando come substrato la caseina e studi di zimografia hanno evidenziatio debole attivitá enzimatica intorno ai 45 kDa. La tecnica di agar-torlo d’uovo ha altresí rivelato una debole attivitá di fosfolipasinell’estratto. La caratterizzazione dell’attivitá enzimatica ha determinato la presenza solo di proteasi e l’assenza di enzimi che causano danno agli umani come ialuronidasi e fosfolipasi. I risultati riscontrati nella caratterizzazione biochimica, concordano con ció che si osserva per la maggioranza delle specie di scorpione.

Il veleno di scorpione é stato valutato in un pannello di 16 linee cellulari di varia origine istologica (11 tumorali, 3 normali, 2 sistema immune). L’effetto del veleno ha evidenziato una significativa attivitá tossica in cellule tumorali di origine epiteliale (polmone > laringe > cervice > colon > mammella > fibrosarcoma > neuroblastoma) mentre le cellule tumorali ematopoietiche, le cellule normali e del sistema immune non hanno presentato sensibilitá. Questo risultato evidenzia la significativa e differenziale tossicitá del veleno dello scorpioneR. junceussulle cellule tumorali di origine epiteliale. La valutazione dei meccanismi di azione ha rivelato che il veleno é capace di indurre la morte cellulare per apoptosi. Tuttavia, é altresí capace di causare necrosi in cellule tumorali che non presentano la cascata di attivazione dell’apoptosi intatta, che dimostra una versatilitá nei meccanismi di induzione di morte cellulare.

La capacitá antitumorale del veleno, é stata valutata in un modello di adenocarcinoma mammario nei topi. I risultati hanno mostrato che la sommistrazione dell’estratto, per via orale o intraperitonale, provoca una diminuzione significativiva della progressione tumorale dosi dipendente. Allo stesso modo la somministrazione del veleno in animali con mestastasi polmonari ha diminuito significativamente la comparsa e la frequenza di queste nei polmoni. I risultati nei modelli sperimentali in vivo con tumori impiantati evidenziano che per entrambe le vie di somministrazione il veleno é capace di diminuire significativamnete la progressione tumorale e le metastasi polmonari.

La biodistribuzione durante le 24 ore in animali sani, per via endovenosa, ha mostrato che il veleno si distribuisce rapidamente dal compartimento centrale (sangue) verso il periferico (tessuti) dimostrando una elevata affinitá per questi. Addizionalmente, si é osservata una marcata e sostenuta presenza del veleno nei polmoni dalla somministrazione fino alle 8 ore. I livelli di veleno nel polmone sono stati significativamente superiori rispetto al resto degli organi, compreso il sangue. Solo i reni nei primi minuti hanno superato questo comportamento. Ció evidenzia una rapida chiarificazione o eliminazione di una porzione dell’estratto, nei primi minuti successivi alla sommistrazione. Per via orale il veleno ha avuto un comportamento simile negli organi analizzati, mentre nei polmoni la sua presenza é stata molto meno marcata che per via endovenosa, ma superiore al resto degli organi. Questo risultato dimostra che per entrambe le vie i polmoni rappresentamo l’organo bersaglio e suggerisce una elevata e mantenuta biodisponibilitá del veleno rispetto ai restanti organi. Questi risultati concordano con la sensibilitá differenziale dell’estratto verso le linee cellulari tumorali del polmone osservato nei modelli sperimentali in vitroe con la marcata attivitá antimetastasica nei polmoni nei modelli sperimentali in vivo.

L’interazione del veleno con droghe antineoplasiche convenzionali (ciclofosfamide, 5-fluoruracilo, cisplatino) é stata valutata in cellule tumorali del polmone umano in vitroe nel cancro della mammella in vivo. Le concentrazioni dei chemioterapeutici nel trattamento combinato con il veleno, per ognuno dei tempi valutati, sono stati significativamente inferiori a quelli ottenuti quando si impiegano come semplici agenti per ridurre al 50% la crescita cellulare in vitro. Negli esperimentiin vivola presenza del veleno ha aumentato significativamente l’effetto antitumorale di questi. La presenza del veleno di scorpione in combinazione con la terapia convenzionale, rende possibile il raggiungimento di percentuali di inibizione della crescita significativamente superiori rispetto al trattamento semplice.

 

– Attivitá antinfiammatoria

Modello di infiammazione acuta per induzione di edema auricolare nel topo per olio de croton.

Sono stati somministrati 5, 10 e 20 mg/kg per via orale e topica, le tre dosi di veleno somministrate per via orale sono state capaci di ridurre l’infiammazione causata dall’agente irritante di un 35,72% (5mg/Kg, 37,39% (10mg/Kg) e 38,02% (20mg/Kg). Per via topica la riduzione dell’infiammazione é stata del 16,03% (5mg/Kg), 18,00% (10mg/Kg) e 26,41% (20mg/Kg).

Modello di impianto di tamponi  di cotone nei topi.

Le dosi sperimentate sono state di 10 e 20 mg/Kg di veleno due volte al giorno per 7 giorni che hanno diminuito il peso secco dei granulomi ottenendosi una percentuale di inibizione dell’infiammazione del 26,46% (10mg/Kg) e del 14,18% (20mg/Kg).

 

-Attivitá analgesica

Modello di induzione di contorsioni per acido acetico nei topi

Sono state somministrate 1, 5, 10, 15, 20 e 50 mg/Kg di veleno, che sono state capaci di inibire il numero di contorsioni addominali negli animali sottoposti ad esperimento rispettivamente del 16,59%, 30,74%, 32,78%, 38,19%, 41,6% e 53,53%.

 

Modello di analgesia termica nei topi

Sono state somministrate dosi da 2,5, 5,0 e 7,5 mg/Kg per via intraperitoneale che hanno prodotto un effetto analgesico superiore al 100% trascorse 2 ore dall’inoculazione del veleno R. junceus.

 

Modello di angiogenesi infiammatoria

Si é proceduto secondo la tecnica descritta da Kobayashi e col. (1998) e sono state sperimentate le dosi da 3 e 5 mg/Kg via intraperitoneale per ottenere una diminuzione statisticamente significativa per il peso dei granulomi formati per entrambe ledosi rispetto al gruppo controllo sperimentato.Anche il contenuto di carminio (come indicatore di vascolarizzazione), nei campionidi granulomi degli animali trattati con le dosi di veleno, é stato minore che nei campioni del gruppo controllo, evidenziandosi per questo prodotto un effetto antiangiogenico.

 

Studi tossicologici 

E’ stata valutata la sicurezza tossicologica del veleno di scorpione Rhopalurus junceus attarverso uno degli esperimenti dettagliati in numerose guide internazionali:

 

– Tossicitá Acuta Orale (OECD 423). Non é stata segnalataletalitá né variazioni nel comportamento del peso corporeo come anche segni di tossicitá ritardata negli animali da esperimento utilizzati,compresi quelli sottoposti alla dose maggiore sperimentata (2000mg/Kg)che ha permesso di collocare il prodotto nella categoria tossicologica “Senza classificazione”(DL50>2000 mg/Kg).

 

Tossicitá Acuta Intraperitoneale.  E’ stato segnalata un valore di Dosi Letale Media (DL50) da 16,41% mg/KG per questa via di somministrazione, classificandosi come di “bassa tossicitá” d’accordo con il sistema di classificazione per animali velenosi.

 

 

-Studio tossicologico per 28 giorni.  Nello studio a dosi ripetute del veleno di scorpione Rhopalurus junceus, per 28 giorni per via orale nei topi, alla dose di 100 mg/Kg, non sono stati osservati segni tossici ne mortalitá provocate dalla somministrazione della sostanza di prova né alterazioni nei parametri ematologici e biochimici.

 

-Studio tossicologico subcronico per 90 giorni.  Nello studio subcronico per 90 giorni per via orale  nei topi a dosi fino a 100 mg/Kg, non sono stati osservati segni tossici né mortalitá, né variazioni biochimiche ne ematologiche. Il peso relativo di organi non é stato danneggiatoe a seguito della somministrazione della sostanza di prova.

 

-Irritabilitá acuta e cronica nella mucosa orale: Al somministrarsi in formaacuta e cronica, il veleno non é irritante sulla mucosa orale.

-Irritabilitá dermica: Il veleno non risulta essere irritante dermico

-Irritabilitá oftalmica: Il veleno non risulta essere irritante oftalmico

 

-Genotossicitá: E’ stato utilizzato l’esperimento di micronuclei nel midollo osseo del topo osservandosi che il veleno, somministrato per via orale, non produce clastogenicitá ne citotossicitá.

 

Esiste fino ad oggi un cumulo importante di risultati sperimentali di attivitá farmacologica, in una varietá di modelli preclinici che confermano le grandi potenzialitá del veleno dello scorpione cubano come agente antitumorale e che, sommato alla sicurezza tossicologica nei modelli di tossicologia stabiliti dai regolamenti internazionali per dimostrare tali effetti, promuovono saddisfacentemene l’utilizzazione di questo estratto naturale in pazienti umani affetti da cancro.